亚硒酸钠对人白血病的研究(一)
来源:未知 更新时间:2011-04-14 18:05 作者:补硒协会编辑 点击:次
摘 要
目的和方法：实验观察亚硒酸钠对人急性髓性白血病细胞系HL-60细胞生长增殖、诱导分化、细胞内自由基产生和清除系统以及胞内环核苷酸累积的影响，探索亚硒酸钠对人白血病HL-60细胞作用机制。
目的和方法：实验观察亚硒酸钠对人急性髓性白血病细胞系HL-60细胞生长增殖、诱导分化、细胞内自由基产生和清除系统以及胞内环核苷酸累积的影响，探索亚硒酸钠对人白血病HL-60细胞作用机制。
结果：8×10-6mol/L或更高浓度的亚硒酸钠均可显著抑制HL-60细胞的生长增殖，作用5 d可在一定程度上诱导HL-60细胞向成熟粒细胞方向分化。8×10-6mol/L亚硒酸钠作用一段时间，可增强自由基清除系统酶活性，减低胞内自由基水平，降低细胞内cGMP累积而对cAMP 累积无明显影响。
结论：硒的抗白血病作用可能与亚硒酸钠的这些作用相关。
Possible mechanism of antileukemic
effect of sodium selenite
WEI Yi-Sheng JIN Jing-Jun
1Fujian
LIN De-Xin YANG Li-Li YE Qing-Lin
2
Abstract AIM and METHODS:To study the mechanism of antileukemic effect of sodium selenite, the effect of sodium selenite on the growth of HL-60 cells, its differentiation to mature granulocytic cells, activity of enzyme for free radical production and for their clearance, and accumulation of cyclic nucleotide were examined.RESULTS：8×10-6mol／L-1.6×10-5mol／L sodium selenite inhibite significantly the growth of HL-60 cells, being dose dependent. Exposure to 8×10-6mol／L sodium selenite for 5 d induced differentiation of HL-60 cells in the direction of mature granulocytic cells to some extent. Exposure to 8×10-6mol／L sodium selenite for 1～5 d increase activity of enzymes for clearing of free radical( indicated by SOD), decrease the content of free radical in cells (indicated by mDA) as time passes on. Exposure to 8×10-6mol／L sodium selenite for 30 min has no effect on cAMP accumulation in cells either at rest or stimulated by adrenalin, but decreases cGMP accumulation and increases cAMP/cGMP ratio in the same time.CONCLUSION：It suggested that beside owing to a possible potential differentiation induction under certain circumstances, antileukemic effect of sodium selenite, may partially involve the increase of activity of enzymes for clearing free radical that cause decrease of free radical in cells.
MeSH Selenium; Leukemia; Cells
近年来的研究表明，硒有防止肿瘤发生、抑制肿瘤生长增殖、促进恶性肿瘤细胞逆转分化的作用，但有关硒防治肿瘤的机制并未阐明。本研究实验观察亚硒酸钠抑制HL-60细胞生长增殖，促进其逆转分化的作用，同时观察亚硒酸钠对HL-60细胞的自由基产生和清除系统以及对细胞内环核苷酸累积的影响，探讨亚硒酸钠抗白血病作用的机制。
材料与方法
(一)人急性髓系白血病细胞系HL-60细胞(AML-M2型白血病细胞)的培养：HL-60细胞引自中国医学科学院药物研究所，以含10%新生小牛血清的RPMI1640培养液培养于二氧化碳培养箱(5%CO2，95%空气，饱和湿度)，每3～4 d传代1次。
(二)HL-60细胞生长曲线的绘制：取对数生长期HL-60细胞，以1×104／mL密度接种25 mL培养瓶，每瓶5 mL，置二氧化碳培养箱培养24 h后，实验组分别加8×10-4mol／L亚硒酸钠50或100 μL使终浓度分别为8×10-6mol／L和1.6×10-5mol／L，对照组加入100 μL完全培养液，均各两平行瓶。于加亚硒酸钠后1～9 d，每日从各瓶无菌取样50 μL，加同体积0.4%台盼蓝溶液混匀，以血细胞计数板计数活细胞，取各平行瓶的均值。重复3次。以培养时间为横坐标，活细胞数为纵坐标绘制生长曲线。
(二)HL-60细胞生长曲线的绘制：取对数生长期HL-60细胞，以1×104／mL密度接种25 mL培养瓶，每瓶5 mL，置二氧化碳培养箱培养24 h后，实验组分别加8×10-4mol／L亚硒酸钠50或100 μL使终浓度分别为8×10-6mol／L和1.6×10-5mol／L，对照组加入100 μL完全培养液，均各两平行瓶。于加亚硒酸钠后1～9 d，每日从各瓶无菌取样50 μL，加同体积0.4%台盼蓝溶液混匀，以血细胞计数板计数活细胞，取各平行瓶的均值。重复3次。以培养时间为横坐标，活细胞数为纵坐标绘制生长曲线。
(三)HL-60细胞诱导分化的形态学观察：HL-60细胞按2×105／mL的密度接种于25 mL培养瓶，每瓶4 mL，共6瓶。实验组每瓶加3.2×10-4mol／L亚硒酸钠应用液0.1 mL，使终浓度为8×10-6mol／L，阴性对照组加同体积完全培养液，阳性对照组加DMSO使终度为1.25%。各两平行瓶。置
(四)NBT反应：按参考文献方法进行。
(五)MDA含量测定：硫化巴比妥钠酸(TBA)荧光法，结果以nmol/mg pr表示。
(六)超氧化物歧化酶(SOD)活性测定：取样品加氯仿酒精混合液，混匀，3 500 r/min离心10 min，吸上清液，按Pyrogallol-NBT比色法测定。
(七)环核苷酸累积测定：同批培养的HL-60细胞分别分为对照管和实验管，每管加3-异丁基1甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine, IBMX)800 μmol/L，保温
(八)蛋白质测定方法：采用Lowry等方法，牛血清白蛋白(fraction V)作为标准品。
结 果
(一)亚硒酸钠对HL-60细胞生长、增殖的影响：亚硒酸钠8×10-6mol／L和1.6×10-5mol／L对HL-60细胞生长增殖均有显著影响(图1)。且呈剂量依赖性的抑制作用。
(二)亚硒酸钠对HL-60细胞的诱导分化作用：亚硒酸钠(终浓度8×10-6mol／L)作用5 d可在一定程度上诱导HL-60细胞分化，出现细胞形态学的右移(表1)，NBT实验的阳性率增高。亚硒酸钠组NBT试验阳性率(50.75±6.72)%，与阳性对照组DMSO(55.50±16.26)%相近，而与阴性对照组(9.25±2.47)%差异非常显著(P＜0.01)。
表1 亚硒酸钠作用下HL-60细胞的形态学改变
Tab 1 Effects of sodium selenite on morphology of HL-60 cells (n=200)
|
Group
|
Morphology(%)
|
||||
|
MB
|
PM
|
MY
|
MM
|
MG
|
|
|
Control
|
42.0
|
45.0
|
12.1
|
0.9
|
0
|
|
DMSO
|
20.3
|
48.7
|
23.2
|
7.0
|
0.8
|
|
Sod.selenite
|
25.8
|
55.5
|
17.3
|
1.2
|
0.2
|
MB:Myeloblast PM:Promyelocyte, MY:Myelocyte,; MM:Metamyelocyte； MG:Mature granulocyte (including band form and segmented)
(三)亚硒酸钠对HL-60细胞自由基产生和清除系统的影响：8×10-6mol／L亚硒酸钠作用1、 3、 5 d，可见HL-60细胞自由基的产生量(以MDA为指标)随硒作用时间的加长逐步减少，而HL-60细胞对自由基的清除能力(以SOD活性为指标)则随硒作用时间的加长而逐步增高(表2)。
本文关键词：
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